Расскажи друзьям!

Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции

Из всех существующих болезней, инфекционные болезни являются самыми частыми и распространенными среди населения всех стран, они приводят в общей сложности к самым большим трудопотерям. Самая серьезная из них - это ВИЧ-инфекциия. К середине 1996 года общее количество инфицированных вирусом иммунодефицита во всем мире достигло 27,9 миллионов человек.

В настоящее время накоплен немалый опыт отечественными и зарубежными учеными в лечении и реабилитации больных СПИДом, однако, до сих пор не зафиксирован случай полного выздоровления, поэтому СПИД считают болезнью с летальностью 100%.Если раньше этой инфекцией заражались наркоманы, гомосексуалисты, проститутки, то с начала девяностых годов ВИЧ все более и более завоевывает основную популяцию населения. Несмотря на извещение об уголовной ответственности за заражение, обнаружение ВИЧ-инфицированных лиц не приводит к прекращению передачи от них ВИЧ.

Проблемы прогнозирования клинического течения ВИЧ-инфекции требуют дальнейшего исследования, но, однако довольно хорошо изучены ключевые лабораторные диагностические показатели, которые говорят об инфицированности. Прогноз перехода от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ), а также от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний имеют наибольшую клиническую роль. Отсутствие надежных клинических и лабораторных показателей перехода инфекционного процесса из латентной стадии в манифестную, отсутствие методов ранней диагностики, полная неуправляемость патологических процессов у заболевшего-это только некоторые главные не разрешенные проблемы СПИДа. Группа недавно открытых внутриклеточных белков, называемых "белки теплового шока" (БТШ) или "стрессовые белки" имеют непоследнее значение в поиске новых тестов, дающих представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при ВИЧ-инфекции. Имеются данные, по которым эти белки высоко консервативны в процессе филогенеза, играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах, как в экстремальных, так и в нормальных условиях.

На влияние различных причин создается неспецифическая клеточная реакция, которая является одним из механизмов дестабилизации генома клеток-мишеней и сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления, синтезом белков теплового шока и. В этих условиях существенное значение имеет фермент ксантиноксидазы, служащий генератором свободных радикалов при ряде патологических состояний клетки.

Впервые определено, что нарастание накопления конститутивной изоформы белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных пропорционально степени выраженности клинических проявлений болезни. Также в исследованиях была представлена связь изменения показателей белков семейства БТШ-70 с уровнем нестабильности генома, активностью процессов свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией. Установлено, что изменение состояния белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови отображает возможность перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии и от персистирующей генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний.

Для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу ПГЛ и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний может быть применен комплекс показателей, отражающих состояние системы белков теплового шока, системы ксантиноксидазы, процессов свободнорадикального и нестабильности генома мононуклеаров периферической крови. Переход клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний характеризуется повышением содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови.

Показатели белков семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови в совокупности с традиционными иммунологическими показателями, возможно, использовать для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Изменения содержания белков семейства БТШ-70 в процессе ВИЧ-инфекции происходят на фоне увеличения показателей нестабильности генома, интенсификации процессов свободнорадикального окисления и повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови.

Было обследовано 34 инфицированных и больных ВИЧ-инфекцией, находившиеся на стационарном наблюдении в больнице N 30 имени С.П. Боткина г. Санкт-Петербурга, Республиканской клинической инфекционной больнице г. Усть-Ижоры Ленинградской области, в Центре по борьбе и профилактике СПИДа г. Санкт-Петербурга. Иммунологические и биохимические исследования проводили в Военно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук. Все обследованные преимущественно были мужчины в возрасте от 20 до 39 лет. ВИЧ-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Пациенты были разделены на группы, в контрольную вошли 25 военнослужщих, практически здоровых мужчин (доноров крови) в возрасте от 20 до 39 лет. У пациентов исследовали долю лейкоцитов, лимфоцитов; субпопуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" с применением моноклинальных антител ; количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, находили методом радиальной иммунодиффузии в геле ; содержание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова .

В ходе обследования была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очистки антител использовали препарат белков БТШ-70. Для его получения применяли белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содержал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70. Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 методами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70 использовали "сэндвич” - метод иммуноферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [35S]-метионином. Иммунопреципитаты были подвергнуты одно- и двумерному электрофорезу. Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон белков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных.

Чтобы обследовать состояние системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови применяли нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда". Уровень процессов свободнорадикального окисления оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara . В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избраны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, и интенсивность образования однонитевых разрывов ДНК.

Обработку данных реализовывали методом вариационной статистики с применением параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты совершали с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1.

Разбор изменений иммунологических параметров пациентов разрешает сделать вывод о том, что в динамике ВИЧ-инфекции совершается прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания, но далеко не все обследованные параметры в своей динамике точно отображают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Справедливая разница между группами пациентов с ВИЧ-инфекцией отмечалось у таких показателей, как повышение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р<0,05), снижение содержания СD8+-лимфоцитов (супрессоров) ОТ 36,90±2.90 до 27,83±1,80% (p<0,01); рост содержания В (IgA+) лимфоцитов от 0,06±0,01 до 0,10±0,01xlO9/л (p<0,01), повышение концентрации IgG от 11,74±0.89 до 13.77±0.66 г/л (р<0.05), увеличение содержания циркулирующих иммунных комплексов - снижение пропускания светового потока от 92,1±1,2 до 84.3±1.6% (р<0,01) при переходе от ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) .

При рассмотрение видно, что относительные показатели во многих эпизодах нельзя применять без оценки абсолютных значений. Абсолютное содержание В(IgA+)-лимфоцитов остается неизменным на стадии IIIA по сравнению с бессимптомной фазой, изменение концентрации иммуноглобулинов IgG проистекают в диапазоне нормальных значений (9-15 г/л), что снижает прогностическую информативность указанных показателей. Учитывается еще и то, что нет единого иммунологического показателя, который бы точно характеризовал оба перехода ВИЧ-инфекции - от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний. Повышение средних значений содержания ТБК-связывающих соединений в мононуклеарах периферической крови на 56%, а в их ядрах - на 90% фиксируется в бессимптомной фазе у ВИЧ-инфицированных . По мере формирования болезни уровень продуктов свободно радикального окисления возрастает, достигая максимума у больных в стадии IIIB, при этом средние значения в группе больных в стадии IIIB превышали контрольные в 3.2 раза в мононуклеарах и в 4,6 раза в ядрах мононуклеаров. Но достоверный рост показателей свободнорадикального окисления между группами больных ВИЧ-инфекцией замечается в мононуклеарах. но не в ядрах, и только в одном из интересующих нас переходах клинического течения - из бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) от 2,82±0,30 до 3,61±0.37 нмоль/106 клеток (р<0,01).

В процессе развития болезни у большинства пациентов замечается прогрессивное увеличение общей ксантиноксидазной активности в мононуклеарах периферической крови. Во время прогрессирования заболевания совершается постепенное уменьшение средних значений активности D-формы ксантиноксидазы (на 12,5% в стадии IIB и на 75,5% в стадии III В) и нарастание активности 0-формы фермента (на 13,4% в стадии ПБ и в 6,5 раз в стадии IIIB). При этом уменьшения активности D-формы ксантиноксидазы в переходах клинического течения IIБ-IIB и IIB-IIIA не отмечается, а активность 0-формы достоверно возрастает только при переходе от бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) (р<0,05).

Интегральные метаболические показатели дестабилизации генома мононуклеаров периферической крови

У ВИЧ-инфицированных уже в бессимптомной фазе отмечается увеличение средних значений содержания полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 раза, а выраженности однонитевых разрывов ДНК в 2.3 раза. Выявленные изменения прогрессируют по мере развития ВИЧ-инфекции, однако достоверных различий показателей нестабильности генома между группами больных не отмечается, что не позволяет рассматривать их в качестве прогностических критериев перехода клинического течения болезни из одной стадии в другую.

Характеристика поликлональных антител к белкам семейства БТШ-70

Каждый из полученных нами препаратов антител распознавал специфический профиль изоформ семейства БТШ-70, денатурированных додецилсульфатом натрия. Антитела из сыворотки кролика N5 (антитела N5) различают две зоны молекулярной массы 68-72 кДа, которые представляют собой две изоформы семейства БТШ-70. Тепловое воздействие (43°С - 30 минут) на клетки HeLa, белковый экстракт которых использовали для приготовления иммуноблота. отражалась на результате иммуноблота усилением интенсивности зоны, соответствующей hsp70. Антитела N7 распознавали и hsp70. и р75, тогда как антитела N10 главным образом связывались только с р75. a Nil - с hsp70. Такие же примеры распознавания белков семейства БТШ-70 на иммуноблотах наблюдались, когда вместо клеток HeLa для анализа использовали мононуклеары периферической крови человека.

Для того чтобы определить компоненты семейства БТШ-70, которые реагируют в неденатурированном состоянии с представленной панелью антител, выполнено исследование иммунопреципитации. И одно-, и двумерные электрофоретические анализы иммунных комплексов не показывали различий между антигенами, преципитированными с тестируемыми антителами: иммунные комплексы содержали только одну зону, соответствующую индуцибельной форме hsp70. Иммобилизованные на твердой фазе антитела N5 и N7 также избирательно реагировали с антигеном hsp70 из белкового экстракта клеток HeLa.

В итоге, по причине особых свойств полученных антител к БТШ-70. которые, как, оказалось, распознают только один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах БТШ-70. а также по причине свойств белков семейства БТШ-70 легко образовывать прочные соединения е другими белками клетки в обычных условиях, не представилось возможным использовать полученные поликлональные антитела

для создания иммуноферментной тест-системы, предназначенной для количественного определения БТШ-70 в белковых экстрактах мононуклеаров периферической крови. Поэтому пришлось использовать указанные антитела в конструкции другого метода для определения БТШ-70 в белковых экстрактах - метода иммуноблотинга с -последующей денситометрией проявленных зон белков.

Изменения состояния семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови на различных стадиях ВИЧ-инфекции

Семейство БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови всех групп обследованных представлено полностью тремя изоформами: индуцибельной (hsp-70), конститутивной (hsc-70) и белком р75. Не обнаружено достоверных различий в соотношении изоформ БТШ-70 между донорами и пациентами в бессимптомной фазе ВИЧ-инфекции. Напротив, у больных в более поздних стадиях заболевания выявлено достоверное изменение анализируемых параметров по сравнению с контрольной группой. Наблюдается прогрессивное уменьшение средних значений содержания изоформ hsp-70 и р75, увеличение hsc-70 по мере развития клинической картины заболевания. Однако достоверное различие изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдали только по отношению к конститутивной изоформе (hsc-70), содержание которой увеличивается при переходе заболевания из бессимптомной фазы (ПБ) к фазе ПГЛ (IIB) от 59,3±2,5 до 66.2±2,7 у.д.е. (р<0,05) и от фазы ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) от 66,2±2.7 до 7l,l±3,0 у.д.е. (р<0,05).

Индекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. характеризует реакцию клетки на экстремальное влияние синтезом и накоплением индуцибельной изоформы, по которому можно определять адаптивную состоятельность исследованных клеток, этот индекс представляет собой связь содержания индуцибельной изоформы семейства БТШ-70 в клетке, подвергнутой тепловому шоку , к содержанию этого белка в клетке, находящейся при t=370С.В ПБ - IIB от 4,23 до 3.42 (р<0,05) и IIB - IIIA от 3,42 до 2.99 (р<0.05) происходит достоверное понижение индекса hsp-70 TlB/hsp-70 N .Это говорит о прогрессивном ослаблении адаптивной функции мононуклеаров периферической крови. Похожие сдвиги в системе белков теплового шока во всех группах пациентов активизировало влияние ультрафиолетового облучения на нононуклеары периферической крови. Изучение этого воздействия разрешило обнаружить прогрессивное достоверное понижение содержания индуцибельной изоформы hsp-70 при переходах ПБ к IIB от 38,9±4,3 до 30.4±3.1 у.д.е." и IIB к IIIA от 30,4±3,1 до 22.1±3.7 у.д.е. (р<0,05).

Данные из приобретенных результатов могут обнаруживать значение динамики показателей семейства белков теплового шока БТШ-70 мононуклеаров периферической крови для прогноза перехода клинического развития ВИЧ-инфекции от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Выявленная динамика показателей нестабильности генома сопровождалась значительным повышением концентрации сочетаний, связывающих тиобарбитуровую кислоту, в клетках и их ядрах, что указывает о повреждении ДНК мононуклеаров свободными радикалами. 0-форма ксантиноксидазы, образующаяся из D-формы фермента в итоге ее ограниченного протеолиза является ведущим генератором активных форм кислорода . Протеолитическая же трансформация D-формы ксантиноксидазы в 0-форму может быть прооксидантно-индуцированной.

Существует допущение, по которому повреждение ДНК вызвано свободными радикалами, генерируемыми ксантинок-сидазой. Вследствие атаки ДНК свободными радикалами отмечается создание апуриновых/апиримидиновых сайтов и однонитевых разрывов ДНК мононуклеаров периферической крови, при этом уровень указанных процессов отыскивается в зависимости от клинического течения ВИЧ-инфекции. Формирование же однонитевых разрывов является стимулирующим моментом увеличения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах, а образующиеся олигонуклеотиды могут служить факторами активации экспрессии провирусного генома ВИЧ, интегрированного в ДНК мононуклеаров периферической крови. Эти процессы сопровождаются специфическими изменениями системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови, случающимися в тесной связи с клиническим течением ВИЧ-инфекции. Наиболее существенным является процесс,называемый свободнорадикальным окислением. Указанные изменения БТШ-70 в неинфицированных клетках могут быть опосредованы воздействием вирусного белка gplZO, взаимодействие которого с рецептором CD4 не только активизирует стрессовую реакцию, проявляющуюся рядом функциональных изменений, в том числе и усилением транскрипции с генов БТШ-70 , но и приводит к программированной клеточной гибели - апоптозу зрелых СD4+-лимфоцитов или СD34+-гематопоэтических клеток-предшественников . Экспрессия генов ВИЧ в инфицированных клетках , кодирующих синтез БТШ-70, реализовывается по общим механизмам с участием ядерного фактора NF-kB .

Показатели семейства БТШ-70 в неинфицированных и в инфицированных ВИЧ иммунокомпетентных клетках крови пациентов могут рассматриваться как индикаторы активности репликативного процесса вируса, создания вторичного иммунодефицита (вследствие дисфункции и гибели СБ4+-клеток) и развития клинического течения болезни.

При развитии ВИЧ-инфекции отмечается повышение относительной доли продуктов деградации хроматина (уровня полидезоксинуклеопротеидов) и интенсивности образования однонитевых разрывов ДНК в мононуклеарах периферической крови без достоверных различий в динамике болезни (р>0,05). Увеличение активности 0-формы ксантиноксидазы и интенсивности процессов свободнорадикального окисления в мононуклеарах периферической крови прогрессируют в динамике заболевания, при этом достоверные отличия (р<0,05 и р<0.01 соответственно) прослеживаются только при переходе от бессимптомной фазы к персистирувщей генерализованной лимфаденопатии.Традиционные для оценки иммунного статуса лабораторные показатели, такие как количество CD3+, CD4+, С08+-лимфоцитов, В-лимфоцитов, несущих Ig М, G. А; РТМЛ с КонА; концентрация Ig M, G. А; содержание циркулирующих иммунных комплексов недостаточно полно отражают динамику перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Формирование поликлональных антител высокой специфичности и аффинности, распознающих один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах белков способствуют белки теплового шока семейства БТШ-70 .Это исключает вероятность применения полученных иммуноглобулинов в конструкции иммуноферментных тест-систем для количественного определения БТШ-70, но допускает их применение в методе иммуноблотинга. При переходе клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний происходит достоверное увеличение содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови, характеризующее пребывание иммунокомпетентных клеток в состоянии хронического стресса (р<0.05). Функциональное истощение системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови ВИЧ-инфицированных выражается в уменьшении интенсивности ответа на стрессорные влияния в виде гипертермии и ультрафиолетового облучения.

В совокупности с показателями свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров , динамика изменений белков теплового шока семейства БТШ-70 отвечает клиническому развитию ВИЧ-инфекции, что разрешает применять их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Введение этих способов в комплексное лабораторно-диагностическое исследование пациентов с ВИЧ-инфекцией разрешает прогнозировать клиническое течение заболевания.

В опытах, сориентированных на исследование патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях метод оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением, например гипертермии и ультрафиолетового излучения является наиболее эффективным. Все показатели, отражающие состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови, вместе с традиционными показателями иммунного статуса могут быть использованы для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний присуще увеличение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е.

Список литературы

1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19.

2. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.).

3. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко).

4. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции //

Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).

5. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.).

6. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др.).

7. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко).